CCK8試劑盒日本同仁常見問題解答(一)

 　　CCK8試劑盒日本同仁是常用的試劑盒之一，很多客戶在使用時都會有一些疑問，北京沃比森整理總結一些常見的問題，希望給大家一些參考和借鑒。

　　1、一個孔中應接種多少個細胞?當使用標準96孔板時，貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

　　2、CCK8試劑盒日本同仁能否對活細胞進行染色?不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8)，并通過電子載體1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能對細胞進行染色。

　　3、CCK8檢測溶液對細胞是否有毒?CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是，加到培養基中的CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養，如過夜或者培養數天是可以的。同一個細胞培養液在CCK8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測，如結晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養時，先檢測一下細胞在加入CCK8培養后的活力。

　　4、在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響?如何解決?有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK8發生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養基中加入CCK8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養基 (加CCK8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養基，去掉藥物的影響。

　　5、每次測定的數值不一樣，是什么原因?如何解決?可能會有以下幾個原因： 1. 當在培養箱內培養時，培養板zui外一圈的孔zui容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。 一般情況下，zui外一圈的孔只加培養基，不作為測定孔用。 2. 有可能會因為CCK8沾在壁上而產生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1,000100,000個/孔范圍內摸索條件。

　　6、如何設定空白對照?在不含細胞的培養基中加入CCK8試劑盒日本同仁，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

　　7、能否用384孔板進行試驗?可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養基體積20%的量。

　　8、能否用24孔板進行試驗?可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK-8溶液。

　　9、哪些物質會影響CCK8的測定?當有還原性物質存在時會影響CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

　　10、在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數量，如何解決?可以縮短加入CCK8后的培養時間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養時間由2小時縮短為1小時。

　　11、酚紅會影響檢測嗎?不會。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

　　12、CCK8試劑盒日本同仁與胸苷結合檢測之間是否有相關性?有。然而，請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結果可能不同。

　　13、CCK-8能否檢測細菌細胞?可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細胞。向100 μl E.coli培養液中加入10 μl CCK-8溶液，并培養1-4個小時或過夜。

　　14、CCK8試劑盒日本同仁穩定嗎?CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20℃的儲藏條件。

　　15、如果沒有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片?還可使用450 nm到490 nm之間的濾光片。